ELISA 基本原理及步驟

<p>&nbsp;<span style="font-size: 12px;"> &nbsp; &nbsp;ELISA技術(shù)于20世紀(jì)70年代初由荷蘭學(xué)者VanWeeman和Schurrs與瑞典學(xué)者Engvall和Perlman幾乎同時(shí)提出。最初，ELISA主要用于病毒、細(xì)菌的檢測(cè)。20世紀(jì)70年代末，它開(kāi)始廣泛應(yīng)用于抗原、抗體的定性和定量測(cè)定，包括一些藥物、激素、毒素等半抗原分子的定量檢測(cè)。由于ELISA檢測(cè)對(duì)儀器要求低，操作簡(jiǎn)便，特別是樣品前處理簡(jiǎn)單，易于推廣，且具有準(zhǔn)確、靈敏、快速、特異、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，日益成為眾多領(lǐng)域分析技術(shù)研究的熱點(diǎn)。</span></p> <p style="text-align: center;"><span style="font-size: 12px;"><img src="/images/upload/Image/微信圖片_20250331164136.jpg" alt="酶聯(lián)生物ELISA試劑盒" width="500" height="375" /></span></p> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <h3><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp;</span><strong><span style="font-size: 12px;"> ELISA原理</span></strong></h3> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相吸附和酶標(biāo)記。固相載體表面的抗原或抗體仍然保留其免疫活性，而酶標(biāo)記的抗原或抗體則同時(shí)保留了其免疫活性和酶的活性。測(cè)定時(shí)，待測(cè)標(biāo)本（即其中所含的待測(cè)抗體）與固相載體表面的抗原或抗體發(fā)生反應(yīng)。通過(guò)洗滌，固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物可以與液體中的其他物質(zhì)分離，然后加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，該抗原或抗體也通過(guò)反應(yīng)結(jié)合到固相載體上。此時(shí)，固相上的酶量與標(biāo)本中待測(cè)物的含量成一定比例。加入酶反應(yīng)底物后，底物在酶的催化下生成有色產(chǎn)物。產(chǎn)物的量與標(biāo)本中待測(cè)物的含量直接相關(guān)，因此可以根據(jù)顏色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率高，間接放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使檢測(cè)方法更加靈敏?？筛鶕?jù)試劑來(lái)源、標(biāo)本情況和檢測(cè)的具體條件，設(shè)計(jì)不同類型的檢測(cè)方法。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <h3><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; ELISA實(shí)驗(yàn)技巧</span></h3> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 1.加樣</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; ELISA中最常見(jiàn)的操作是加樣，涉及到每個(gè)步驟。目前一般使用移液槍加樣，將規(guī)定的量加入到板孔中。加樣時(shí)，首先要注意將加入的物質(zhì)加入到板孔底部，避免加入到孔壁的上部，并且不要噴濺或產(chǎn)生氣泡。加入不同物質(zhì)時(shí)應(yīng)更換噴嘴，避免交叉污染。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 另外，顯色時(shí)最好使用多通道移液槍快速完成加液過(guò)程，因?yàn)轱@色對(duì)時(shí)間要求較高，最好同時(shí)顯色，加液時(shí)間越均勻，結(jié)果誤差越小。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 2.稀釋</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; ELISA實(shí)驗(yàn)中，準(zhǔn)確的稀釋操作非常重要。為了獲得可靠的結(jié)果，應(yīng)該使用同一型號(hào)的微量移液器和吸頭，并在試管或其他合適的容器中進(jìn)行稀釋，確?；旌暇鶆蚝螅賹⑾♂尯蟮囊后w加入到板孔中。避免在板孔中直接稀釋，以減少誤差和交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 3.洗滌</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 在ELISA過(guò)程中，洗滌雖然不是反應(yīng)步驟，但也決定了實(shí)驗(yàn)的成敗。ELISA依靠洗滌來(lái)分離游離和結(jié)合的酶標(biāo)記，去除殘留在板孔中的未與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及反應(yīng)過(guò)程中非特異性吸附到固相載體上的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍存在的，這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)應(yīng)在洗滌過(guò)程中洗掉?？梢哉f(shuō)，在ELISA操作中，洗滌是最重要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視。操作者應(yīng)嚴(yán)格按照要求進(jìn)行洗滌，掌握洗滌技術(shù)，確保洗滌液充滿每個(gè)孔。洗板后，最好在吸水紙上輕輕拍干（選擇干凈、無(wú)塵或少吸塵的材質(zhì)），并嚴(yán)格遵守洗滌時(shí)間。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 4.顯色</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 顯色是ELISA反應(yīng)的最后一步，酶催化無(wú)色底物生成有色產(chǎn)物。反應(yīng)溫度和時(shí)間也是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可以保持無(wú)色，而陽(yáng)性孔則隨著時(shí)間的推移顏色逐漸加深。適當(dāng)提高溫度有助于加快顯色。定量測(cè)定時(shí)，加入底物后的反應(yīng)溫度和時(shí)間應(yīng)盡可能準(zhǔn)確。定性測(cè)定的顯色可在室溫下進(jìn)行，時(shí)間一般無(wú)需嚴(yán)格控制。有時(shí)可根據(jù)陽(yáng)性對(duì)照孔和陰性對(duì)照孔的顯色情況，適當(dāng)縮短或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，并及時(shí)判斷。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 5.數(shù)據(jù)讀取</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 比色前應(yīng)先用干凈的吸水紙吸干酶標(biāo)板底部附著的液體，以減少對(duì)比色的干擾，然后將酶標(biāo)板正確放入酶標(biāo)儀的比色架上。酶標(biāo)儀應(yīng)放置在避光環(huán)境中，操作溫度為15～30℃。使用前應(yīng)將酶標(biāo)儀預(yù)熱15～30分鐘，以使結(jié)果更穩(wěn)定。</span></div>