elisa底物顯色原理

ELISA是一種廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)和生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定實(shí)驗(yàn)，用于定性和定量檢測(cè)各種生物分子，例如蛋白質(zhì)、抗體、肽、糖蛋白和激素。   　　在ELISA實(shí)驗(yàn)中，目標(biāo)抗原或抗體會(huì)被固定在聚苯乙烯微孔板上。然后，加入酶標(biāo)記的抗體（或抗原，取決于ELISA類(lèi)型）與目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行特異性結(jié)合，并在孵育后形成復(fù)合物。未結(jié)合的試劑通過(guò)洗滌步驟去除。<o:p></o:p>   　　最后，加入特定的底物，酶催化底物反應(yīng)，產(chǎn)生可檢測(cè)的顏色變化或熒光/發(fā)光信號(hào)。通過(guò)測(cè)量這些信號(hào)，可以定量或定性分析目標(biāo)物質(zhì)的濃度。ELISA實(shí)驗(yàn)有多種類(lèi)型，例如雙抗體夾心法、間接法、競(jìng)爭(zhēng)法等，每種類(lèi)型都有其特定的操作步驟和應(yīng)用場(chǎng)景。<o:p></o:p>   　　ELISA實(shí)驗(yàn)中，在洗滌去除未結(jié)合的酶標(biāo)記物后，將含有反應(yīng)結(jié)合物的ELISA板與合適的底物一起孵育。底物的選擇取決于與抗體偶聯(lián)的酶的類(lèi)型，例如辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶(AP)。酶催化底物反應(yīng)，產(chǎn)生可檢測(cè)的顏色變化、熒光或發(fā)光信號(hào)，從而放大信號(hào)并可視化板中發(fā)生的反應(yīng)。<o:p></o:p>   　　ELISA實(shí)驗(yàn)中的一些常用底物是過(guò)氧化氫、魯米諾和對(duì)硝基苯基磷酸鹽(pNPP底物)。在本文中為大家詳細(xì)介紹下這些底物在ELISA實(shí)驗(yàn)過(guò)程作用方式、它們功能及其在不同醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室和行業(yè)中的應(yīng)用。<o:p></o:p>   　　在ELISA反應(yīng)體系中，酶標(biāo)記的抗體（或抗原）與目標(biāo)抗原（或抗體）結(jié)合后，加入相應(yīng)的底物。酶會(huì)催化底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)，例如顏色變化、熒光或電化學(xué)信號(hào)。這些信號(hào)的強(qiáng)度與樣本中目標(biāo)抗原（或抗體）的濃度成正比?？梢允褂梅止夤舛扔?jì)、熒光計(jì)或電化學(xué)檢測(cè)器等儀器測(cè)量這些信號(hào)，從而定量樣本中目標(biāo)物質(zhì)的含量。<o:p></o:p>   　　不同的底物在與酶發(fā)生氧化反應(yīng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生不同的顏色。例如，辣根過(guò)氧化物酶底物與HRP酶反應(yīng)后會(huì)產(chǎn)生以下結(jié)果：<o:p></o:p>   <ul> <li>　　ABTS（2,2′-聯(lián)苯二胺[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二銨鹽）：綠色<o:p></o:p></li> <li>　　TMB（3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺）：橙色<o:p></o:p></li> <li>　　OPD（鄰苯二胺）：藍(lán)色<o:p></o:p></li> </ul>   　　產(chǎn)生的顏色量或獲得的信號(hào)與結(jié)合固定在96孔板表面的抗原的一抗的量成正比。   <o:p></o:p>  <img src="/images/upload/Image/1(84).png" width="500" height="156" alt="" />   　　為了獲得高質(zhì)量、一致且可靠的蛋白質(zhì)測(cè)量結(jié)果，許多科研人員選擇使用<a href="/category-1-b0.html">ELISA</a><a href="/category-1-b0.html">試劑盒</a>。這些試劑盒提供了進(jìn)行特定ELISA檢測(cè)所需的核心試劑，簡(jiǎn)化了操作步驟，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。相比于自行配制試劑，使用試劑盒通?？梢詼p少實(shí)驗(yàn)變異性，并提高實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性。優(yōu)質(zhì)的ELISA試劑盒通常具有較高的靈敏度和批次間一致性。然而，不同品牌的試劑盒性能可能存在差異，研究人員應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的試劑盒，并在實(shí)驗(yàn)前仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)。部分情況下，仍可能需要自行配制或優(yōu)化某些試劑。<o:p></o:p>  <img src="/images/upload/Image/1 - 副本.jpg" alt="酶聯(lián)生物ELISA試劑盒" width="400" height="300" /> <h3>　　ELISA底物類(lèi)型<o:p></o:p></h3>   　　根據(jù)所使用檢測(cè)方法，ELISA底物可分以下幾大類(lèi)：<o:p></o:p>   　　化學(xué)發(fā)光底物<o:p></o:p>   　　報(bào)告酶-底物反應(yīng)產(chǎn)生的光被用作化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)的信號(hào)。HRP酶使用的化學(xué)發(fā)光底物溶液包括魯米諾。AP酶需要1,2-二氧雜環(huán)丁烷類(lèi)試劑來(lái)產(chǎn)生信號(hào)，該信號(hào)可被X射線膠片或電荷耦合器件(CCD)相機(jī)捕獲。<o:p></o:p>   　　為了增加化學(xué)發(fā)光信號(hào)的強(qiáng)度、持續(xù)時(shí)間和靈敏度，檢測(cè)過(guò)程中也使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物(ECL)。但應(yīng)對(duì)底物進(jìn)行稀釋?zhuān)苑乐巩a(chǎn)生假高強(qiáng)度信號(hào)。<o:p></o:p>   　　顯色底物<o:p></o:p>   　　這些底物與報(bào)告酶反應(yīng)生成有色的不溶性反應(yīng)產(chǎn)物，可用分光光度計(jì)檢測(cè)。該方法中使用的HRP底物包括2'-連氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）；5-氨基水楊酸（5-AS）；3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）；和鄰苯二胺（OPD）。<o:p></o:p>   　　AP酶的底物是5-溴-4-氯吲哚磷酸鹽（BCIP）和硝基藍(lán)四唑（NBT）。通過(guò)使用終止液可以增強(qiáng)所產(chǎn)生的比色信號(hào)，從而獲得更準(zhǔn)確的信號(hào)測(cè)量結(jié)果。<o:p></o:p>  <img src="/images/upload/Image/顯色底物.png" alt="顯色底物" width="400" height="459" /> 　　熒光底物<o:p></o:p>   　　熒光ELISA底物需要熒光計(jì)來(lái)產(chǎn)生正確的激發(fā)光束，使熒光標(biāo)簽發(fā)出信號(hào)。熒光計(jì)通過(guò)其激發(fā)和發(fā)射濾光片測(cè)量信號(hào)。<o:p></o:p>   　　ELISA檢測(cè)中使用的熒光AP底物是4-MUP（4-甲基傘形酮磷酸酯），其在發(fā)射波長(zhǎng)為440nm和激發(fā)波長(zhǎng)為360nm時(shí)產(chǎn)生信號(hào)。HPPA（3-對(duì)羥基苯基丙酸）和HPA（羥基苯乙酸）底物與過(guò)氧化物酶配對(duì)。<o:p></o:p>   　　為ELISA檢測(cè)選擇合適的底物取決于靈敏度（檢測(cè)下限或上限）、時(shí)間要求以及過(guò)程中所需/使用的檢測(cè)設(shè)備類(lèi)型。 <img src="/images/upload/Image/熒光底物.png" alt="熒光底物" width="400" height="402" /><o:p></o:p>   <h3>　　Elisa底物有何用途？<o:p></o:p></h3>   　　ELISA底物對(duì)于ELISA檢測(cè)、擴(kuò)增和量化信號(hào)至關(guān)重要。它們與酶發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生有色產(chǎn)物或信號(hào)，可使用合適的設(shè)備進(jìn)行測(cè)量。<o:p></o:p>   　　ELISA是一種生化檢測(cè)方法，用于識(shí)別和量化生物分子，例如蛋白質(zhì)、肽、糖蛋白和激素。ELISA板含有抗原抗體（與熒光團(tuán)或酶結(jié)合）復(fù)合物的反應(yīng)混合物，與合適的底物一起孵育，以進(jìn)行反應(yīng)可視化，這是ELISA的最后一步。<o:p></o:p>   　　底物與HRP或AP酶發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生不溶性有色反應(yīng)產(chǎn)物或信號(hào)，通過(guò)分光光度計(jì)或熒光分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量。<o:p></o:p>   　　為ELISA選擇正確底物是實(shí)驗(yàn)成功關(guān)鍵步驟之一。為您的ELISA實(shí)驗(yàn)選擇合適的底物，最大限度地提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性！<o:p></o:p>

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