細(xì)胞冷凍保存法及解凍培養(yǎng)技巧

<p>&nbsp;<strong>培養(yǎng)細(xì)胞</strong>時(shí)為防止以下問題，細(xì)胞將做冷凍保存:</p> <p>第一、株化細(xì)胞產(chǎn)生性狀轉(zhuǎn)變。</p> <p>第二、污染。</p> <p>第三、株化細(xì)胞之增殖或生理特性有特定之限制，只能在一定的代數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行增殖培養(yǎng)或進(jìn)行特定實(shí)驗(yàn)。</p> <p>目前可能解決這些困難的方法其中之一是細(xì)胞冷凍保存法，將冷凍細(xì)胞儲(chǔ)于冷凍管中，將其中一部分拿出來做一些必要的檢查，其它的冷凍細(xì)胞則在需要時(shí)拿出來解凍，用來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本方法亦可節(jié)省繼代培養(yǎng)時(shí)所花費(fèi)的勞力、物力，并可防止培養(yǎng)中經(jīng)常發(fā)生意外事故，喪失細(xì)胞珠。因此冷凍保存法為研究上之基本技術(shù)之一。</p> <div>說明 :</div> <div>1.經(jīng)過冷凍保存后的細(xì)胞，其生存率會(huì)下降，冷凍時(shí)之冷卻速度，保存溫度，解凍時(shí)升高溫度的速度以及添加之冷凍保存液之種類、濃度等都可影響細(xì)胞存活率。</div> <div>2. 一般而言，４℃以下慢慢地冷凍，保存于液態(tài)氮中（-196℃）。</div> <div>3. 37℃快速解凍。</div> <div>4.保護(hù)劑（抗凍劑）：添加甘油 （glycerol） （ I0 %左右 ） 或dimethy1sulfoxide （DMSO） （ 5- 10% ） 。</div> <div>5.有些細(xì)胞如果采用上述的方法時(shí)，無法得到高的存活率。此時(shí)，則必需考慮可能傷害細(xì)胞的機(jī)制，添加劑之作用等而來找出適當(dāng)?shù)臈l件來修正。</div> <div>&nbsp;</div> <div>材料 :</div> <div>1.增殖期之細(xì)胞 （9成滿），培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中數(shù)個(gè)。</div> <div>2.冷凍用培養(yǎng)基（2倍） : 培養(yǎng)基內(nèi)加入三倍血清及15% DMSO，保存在冰箱中。</div> <div>3. 冷凍管、保利龍制容器、鋁制ample支持棒。</div> <div>步驟:</div> <div>1.準(zhǔn)備2 x 107cells/ml的細(xì)胞懸浮液。</div> <div>2.冷凍用培養(yǎng)基（2倍） :以微溫水溶解DMSO，在培養(yǎng)基中混合為15% （v/v）。這是DMSO的二倍濃度之溶液。必須在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前在行配制，配好后放在冰箱中，使用量必須和細(xì)胞懸浮液的量相等；使用時(shí)維持在4℃。</div> <div>3.分裝: 在冷凍管管中分別加0.5ml （1/2冷凍管體積）冷凍用培養(yǎng)基（2倍）及2 x 10（7次方）cells/ml的細(xì)胞懸浮液；等量混合。將蓋子扭緊后，在管中部貼上膠帶密封。</div> <div>4.記載卷標(biāo) : 用抗凍marker pen在冷凍管上寫明細(xì)胞名稱、代數(shù)、冷凍的年，月，日等所需要的項(xiàng)目。</div> <div>5.放進(jìn)冷卻的保利龍容器中，而在- 80℃的超低溫槽中放置一個(gè)晚上。</div> <div>6.放進(jìn)液態(tài)氮容器中及保存 : 在支持棒上裝上冷凍管，迅速地放進(jìn)容器內(nèi)。</div> <div>&nbsp;</div>